LEHU乐虎

Small RNA表达芯片

  • 简介
  • 挑战及解决方案
  • 数据库
  • 结果展示

  • Arraystar LEHU乐虎芯片结合直接末端标记和巧妙的探针设计技术，实现对主要LEHU乐虎类群，包括miRNAs、pre-miRNAs、tsRNA、tRNAs和snoRNAs的同时检测与精确定量，为研究疾病中LEHU乐虎的调控功能和挖掘生物标志物潜力给予重要的表达信息。


    芯片优点

    • 同时检测主要的LEHU乐虎类群：miRNA、pre-miRNA、tRNA、tsRNA和snoRNA

    • 直接末端标记和巧妙的探针设计，提高LEHU乐虎检测的灵敏度、特异性和准确性

    • 直接和简化的实验步骤: 克服在LEHU乐虎测序中存在的RNA修饰、RNA折叠阻碍、逆转录阻断、PCR扩增偏倚以及分析不准确的问题

    • 适用于低质量RNA样本：如降解RNA、血清/血浆/体液RNA、FFPE RNA

    • 所需的RNA样本量低至100 ng


    Arraystar LEHU乐虎表达芯片列表

    服务名称 描述 规格
    Arraystar Human LEHU乐虎 表达芯片 定量miRNA，pre-miRNA,snoRNA，tRNA & tsRNA 8 x 15K
    Arraystar Mouse LEHU乐虎 表达芯片 定量miRNA，pre-miRNA,snoRNA，tRNA & tsRNA 8 x 15K



  • 顺利获得测序进行LEHU乐虎定量检测的挑战

    LEHU乐虎测序已被用于分析microRNA和其他LEHU乐虎。然而，利用LEHU乐虎测序数据量化的LEHU乐虎的相对丰度与qPCR / Northern Blot结果不一致。例如，顺利获得LEHU乐虎-seq测得的miR-143的水平比miR-145高40倍，但顺利获得qPCR或Northern Blot测得它们的表达水平相当 ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA [8-10]。LEHU乐虎测序的不准确性主要是由于LEHU乐虎测序文库制备和数据分析过程的偏差对结果造成的误导 ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA [1，2]，在某些情况下，这些与真实丰度的偏差可高达10,000倍 ADDIN EN.CITE  ADDIN EN.CITE.DATA [3-8]。

    •来自RNA修饰的干扰

    在测序文库构建和LEHU乐虎定量过程中，LEHU乐虎内部的修饰（例如m1A、m3C和m1G）会阻碍反转录反应进而中止cDNA合成，导致取得的序列偏向启动端，最终导致构建无偏倚全长序列文库的失败。例如，由于tsRNA TΨC环区域中存在m1A修饰的阻碍，LEHU乐虎-seq通常识别18nt 3'tsRNA，但遗漏了由Northern Blot检测到的更主要的22nt tsRNA异构体。

    •文库扩增的偏差

    为了产生足够的cDNA量进入测序仪，LEHU乐虎测序需要对文库进行PCR扩增[9]。然而，RNA的G/C含量、序列组成、二级结构、长度、PCR的启动以及反应条件都可能导致PCR产物丰度的偏差和扭曲。也就是说，当转录组中的不同模板在PCR反应中一起扩增时，某些模板的优先或阻滞扩增总是会导致取得的产物无法呈现真实的RNA丰度[10]。因此，需要多轮PCR扩增的LEHU乐虎测序定量从来都不能对RNA进行有效的绝对定量，其结果需要使用正交方法进行验证。

    •采用TPM衡量LEHU乐虎表达水平的潜在问题

    在LEHU乐虎测序中，TPM(Reads Per Million reads)值是代表LEHU乐虎 转录本的相对丰度的指标，即测到的样本中总体LEHU乐虎的reads数标准化至1百万后，每个LEHU乐虎的reads数占比。

    然而，如（图1）[1]所示，即使其他RNA的绝对丰度没有变化，一个RNA的绝对丰度变化，就会使得其他所有RNA的TPM值成比例变化。因此，TPM值完全依赖于样本中的RNA组成，且少数高表达的基因表达变化就可以影响整体TPM定量的准确性。实际上，在不同的实验条件或不同研究的数据集中，LEHU乐虎整体表达水平变化很大，导致使用TPM值比较LEHU乐虎在不同样本间的表达差异存在偏差[11，12]。


    图1 miRNA测序的TPM值堆积图。除了*代表的RNA，其他所有miRNA在Baseline和Experiment条件下表达不变。然而，*代表的RNA丰度在Experiment条件下上升至2倍时，会同时导致其他所有miRNA的TPM值相应下降，即使这些miRNA的绝对表达水平没有变化[1]。



    •    样本要求量高

    对于tRNA和tsRNA测序，在文库构建之前，目标RNA的分离和预处理需要5 ug甚至100 ug的总RNA [13]，这使得样品量有限的研究项目难以进行。


    LEHU乐虎准确定量的解决方案

    为了克服这些挑战，Arraystar设计了Arraystar Small RNA芯片。结合末端直接标记和巧妙的探针设计技术，克服了LEHU乐虎测序的诸多问题，在需要的总RNA量更少的情况下，依旧能够作为一种实用且有效的解决方案以高灵敏度和准确度分析全谱LEHU乐虎。

    •提高了LEHU乐虎分析的高灵敏度、特异性和准确性的标准

    顺利获得末端直接标记法，LEHU乐虎顺利获得T4 RNA连接酶直接将pCp-Cy3连接到3 '末端，在这一过程中每一个RNA分子都被一个Cy3标签所标记。这种方法消除了LEHU乐虎-seq中逆转录合成cDNA时由于RNA修饰干扰和RNA折叠阻碍而产生的偏差；避免了测序文库PCR扩增的偏好性；利用DMSO来减少LEHU乐虎存在的RNA结构和序列差异的影响。所有这些都有助于维持天然LEHU乐虎水平的保真度，从而实现比RNA-seq甚至qPCR更精确的无偏倚定量效果。

    巧妙的探针设计采用5'发夹结构和标准化的序列靶向区域，特异性区分只有1~2个核苷酸差异的LEHU乐虎。此外，高亲和力探针杂交确保了即使是低丰度的LEHU乐虎检测也具有非常高的灵敏度。

    •低样本RNA量要求

    Arraystar LEHU乐虎芯片需要的样本总RNA量低至100 ng，这比LEHU乐虎-seq所需的总RNA量要低一个数量级。由于其采用直接末端化学标记的方法，不需要进行RNA预处理从而避免了RNA损失，因此该芯片显著降低了RNA起始量的需求，特别是对于高度修饰的RNA分子类型（例如tRNA和tsRNA）。这一样品量要求低的特点，为样品稀有或供应有限的研究项目给予了机会。

    •适用于低质量的样本

    直接的末端标记对底物RNA序列中的核苷酸损伤相对不敏感，因为它不依赖于顺利获得逆转录扩增的cDNA进行检测。此外，虽然芯片探针不受不相关序列存在的影响，但来自降解RNA样品中丰富rRNA的RNA片段可以污染目标RNA长度范围内的LEHU乐虎，从而降低LEHU乐虎测序结果中对LEHU乐虎的覆盖率。

    由于这些原因，利用LEHU乐虎芯片检测保存、化学处理或降解的样品，例如血清/血浆/体液/FFPE RNA等是特别有利的。

    •同时分析多个LEHU乐虎类群

    顺利获得测序分析不同的LEHU乐虎类群需要单独的测序方法和实验：miRNA-seq，tRNA-seq，tsRNA-seq和用于较长的snoRNA和LEHU乐虎前体的常规RNA-seq。Arraystar LEHU乐虎芯片使用统一的化学标记并与同一个芯片上的不同探针杂交，一次实现对所有主要的LEHU乐虎类群检测。


    参考文献

    [1]   Witwer, K. W. and Halushka, M. K. (2016) RNA Biol [PMID: 27645402]

    [2]   Raabe, C. A., et al. (2014) Nucleic Acids Res [PMID: 24198247]

    [3]   Fuchs, R. T., et al. (2015) PLoS One [PMID: 25942392]

    [4]   Sorefan, K., et al. (2012) Silence [PMID: 22647250]

    [5]   Hafner, M., et al. (2011) RNA [PMID: 21775473]

    [6]   McCormick, K. P., et al. (2011) Silence [PMID: 21356093]

    [7]   Tian, G., et al. (2010) BMC Biotechnol [PMID: 20815927]

    [8]   Linsen, S. E., et al. (2009) Nat Methods [PMID: 19564845]

    [9]   Kapranov, P., et al. (2012) Methods Mol Biol [PMID: 22144202]

    [10]   Dabney, J. and Meyer, M. (2012) Biotechniques [PMID: 22313406]

    [11]   Zhao, Y., et al. (2021) J Transl Med [PMID: 34158060]

    [12]   Zhao, S., et al. (2020) RNA [PMID: 32284352]


    [13]   Shi, J., et al. (2021) Nat Cell Biol [PMID: 33927371]



  • Arraystar Human LEHU乐虎 表达芯片 V1.0

    探针总数 14,707
    探针设计原理 全长探针包括5’端帽子序列、与smallRNA互补配对的特异性结合序列及3’linker序列
    探针位置 5-p-miRNAs and 5'tsRNAs: 针对LEHU乐虎的3’端序列设计
    3-p-miRNAs and 3'tsRNAs: 针对LEHU乐虎的5’端序列设计
    Pre-miRNA: 针对前体miRNA的环序列设计
    tRNA: 针对成熟tRNA的反密码子环序列设计
    snoRNA:针对snoRNA的特异性序列区域设计
    探针特异性 LEHU乐虎高特异性探针
    miRNA 2,627 (1,318个5-p-miRNA, 1,309个3-p-miRNA)
    tsRNA 4254
    miRNA前体 1745
    tRNA成熟体 346
    snoRNA 955
    LEHU乐虎来源 miRNA: miRBase(v22)
    tsRNA: tRFdb, MINTbase, GtRNADb (Updated to 18.1 2019.08)
    pre-miRNA: miRBase(v22)
    tRNA:GtRNADb(更新至18.1 2019.08), ENSEMBL(v99)
    snoRNA:ENSEMBL(v99)
    发表的高分文章
    芯片规格 8 x 15K


    Arraystar Mouse LEHU乐虎 表达芯片 V1.0

    探针总数 14,895
    探针设计原则 全长探针包括5’端帽子序列、与smallRNA互补配对的特异性结合序列及3’linker序列
    探针设计位置 5-p-miRNAs and 5'tsRNAs: 针对LEHU乐虎的3’端序列设计
    3-p-miRNAs and 3'tsRNAs:针对LEHU乐虎的5’端序列设计
    Pre-miRNA:针对前体miRNA的环序列设计
    tRNA:针对成熟tRNA的反密码子环序列设计
    snoRNA:针对snoRNA的特异性序列区域设计
    探针特异性 LEHU乐虎高特异性探针
    miRNA 1949 (966个5-p-miRNA, 983个3-p-miRNA)
    tsRNA 1809
    miRNA前体 1,122
    tRNA成熟体 270
    snoRNA 1,323
    LEHU乐虎来源数据库 miRNA: miRBase (v22)
    tsRNA: tRFdb, GtRNAdb(Updated to 18.1 2019.08)
    pre-miRNA:miRBase(v22)
    tRNA:GtRNAdb(更新至18.1 2019.08), ENSEMBL(v99)
    snoRNA:ENSEMBL(v99)
    发表的高分文章
    芯片规格 8 x 15K

  • 对于每种LEHU乐虎类群，数据分析结果包括检测指标的表达定量值、统计学分析、注释信息和可供发表的高质量图表。

    •差异表达分析（以tsRNA和tRNA为例）

     

    tsRNA_type: tsRNA类型（tsRNA-5, tsRNA-3, tsRNA-1, 5-Leader, 5-tiRNA, 3-tiRNA, and i-tsRNA）。

    tsRNA-sequence: tsRNA序列。

    tsRNA-length: tsRNA长度。

    tsRNA-precursor: tsRNA前体的基因名。

    Level: tsRNA的可信度。

        Functional–文献报道的具有特定生物学功能或疾病关联性;

         Reliable–tsRNAdb收录或文献报道，但未做深入功能机制研究;

         Potential-由Arraystar根据RNA片段长度和tRNA中的切割位置预测的tsRNA。

    Mechanism: tsRNA的分子机制。

    Sequence: tRNA isodecoder的序列。

    Gene name: tRNA isodecoder的基因名。

    GenomeLocus: tRNA isodecoder在基因组上的定位。

    tRNA promoter Locus: tRNA isodecoder的启动子在基因组上的定位。tRNA promoter–包括一个tRNA的基因位置加上基因上游100bp的序列(PMC6108506)。

    pre-tRNA locus: tRNA isodecoder的前体在基因组上的定位。pre-tRNA – tRNA前体包括一个成熟tRNA加上基因上游100bp序列及3’trailer序列。

    tRNA neighboring gene: tRNA isodecoder最邻近的基因名。

     

    •差异表达Small RNAs的层次聚类热图

    图4 差异表达的miRNA的层次聚类热图。